内容提要

我们报道了一种致盲探针HM-DS655-Halo，它在与HaloTag结合之前保持闪烁关闭状态，从而触发其自闪烁活性，并使其能够在活细胞中直接进行SMLM成像。我们采用自眨眼激活前后占空比的比值，称为参数“RDC”来表征眨眼性。与HaloTag的共价结合诱导HM-DS655-Halo从荧光OFF状态转变为荧光闪烁状态。这种转变也导致RDC值的变化，计算为12，确保了在活细胞中有效抑制背景信号的超致盲性。HM-DS655-Halo成功应用于各种细胞内亚结构的动态SMLM成像，背景噪声最小，包括线粒体裂变和接触，细胞迁移和假足生长。荧光探针在与靶结合时表现出显著的荧光增强，被广泛用于消除背景信号。其中，罗丹明基探针表现突出，因为它们存在于非荧光螺旋环和荧光两性离子之间的平衡中以产生荧光性这些探针还与常用的自标记标签HaloTag具有良好的相容性，HaloTag可促进螺环罗丹明偶联形成荧光两性离子，从而具有良好的荧光增强效果。因此，这对基于罗丹明的探针和HaloTag为超分辨率成像提供了一个有吸引力的选择。在本文中，我们提出了探针HM-DS655-Halo响应自发闪烁探针高荧光性的需求。该探针在与目标结合之前保持不闪烁，从而触发强大的自发闪烁活动。HMDS655-Halo源于我们之前报道的在中性pH条件下的自闪烁染料HM-DS655，具有显著的优势。虽然HM-DS655的自闪烁依赖于ph值，并且可能导致非目标相互作用产生不希望的闪烁信号，但HM-DS655- halo表现出独特的“致闪烁”特性，仅在目标识别时产生荧光闪烁。具有这些特征的探针，只显示荧光闪烁以响应目标结合，被归类为“致盲探针”。在这里，我们使用自眨眼激活前后的占空比，称为参数“RDC”来表征眨眼性。占空比表示荧光团保持在“开”状态与“关”状态的时间之比。显示高占空比的探针在荧光“开”状态下花费相当多的时间。相反，具有“低占空比”的探针在非荧光或弱荧光暗状态下花费更多时间。当RDC值超过1时，表示探针在分子识别时发生自闪激活。识别前的低占空比，加上较高的RDC值，将增强信噪比和闪烁特性，从而有利于SMLM成像。HM-DS655-Halo的pKcycl降至4.5以下，有效地稳定了生理条件下（pH 7.4）的闪烁，并保留了探针内罗丹明螺旋环的结构。而与HaloTag结合后，探针的两性离子结构会在HaloTag的微环境中得到稳定，导致持续的自发闪烁。RDC值达到12，表明对HaloTag蛋白的识别选择性地触发探针的自闪烁，在SMLM成像中具有出色的消除背景干扰的能力。最后，使用HM-DS655-Halo，我们成功地实现了细胞内动力学的SMLM成像，包括线粒体裂变和接触，细胞迁移和假足生长。