Angew. Chem. Int. Ed.:酶激活近红外半菁染料在体内光动力治疗中的研究

内容提要

前言

光动力疗法(PDT)结合光、氧和光敏剂(PS)的施用，产生高水平的自由基和/或活性氧(ROS)，导致细胞死亡。PDT作为一种抗癌治疗方法已有多年历史，目前有20多种PDT正在使用或处于临床试验阶段。然而，其中许多PS(包括吲哚菁绿(ICG)和LUZ11，图1)显示出有限的化学可调性，并且缺乏用于生物偶联和/或酶激活的活性基团。目前已经报道了几种化学策略来微调响应UV-Vis激发的PS结构，但它们很少用于近红外(NIR) PS的合成，其大尺寸和疏水性往往导致非特异性结合和暗细胞毒性。

在目前的有机PS中，那些在NIR-I光学窗口(即650-900 nm)具有吸光度曲线的PS与现有仪器具有良好的兼容性，并且在临床前和临床应用方面具有更大的潜力，能够在更深的深度和生理条件下(例如体内PDT)治疗组织。然而，大多数近红外PS在化学模块化方面存在重大障碍，并且它们的生物分布通常通过配方进行微调(例如，装载ICG的脂质体)。很少有可调的近红外支架可以通过生物相容性基团和生物标志物活化基团进行优化，以降低脱靶细胞毒性并提高其抗癌PDT治疗的安全性。可激活PS的优势在于，只有在特定刺激触发后，它们才会引发强烈的光动力学作用。使用有机发色团(如BODIPYs罗丹明或酞菁等)构建了几种可活化探针。这些结构可以通过分子内电荷转移(ICT)或聚集诱导机制被淬灭，并且在靶细胞中表现出比周围组织更强的光动力活性。在激活NIR PS的不同生物标志物中，酶可以很好地区分肿瘤细胞和健康组织，但在生理条件下与体内酶降解兼容的生物相容性NIR- I有机PS实例很少。    

实验结果与讨论

硒代半花菁染料的设计与光物理性质研究

Yuan等人首先报道了半花青素是有吸引力的近红外发色团，因为它们的尺寸相对较小-与花青素7 (Cy7)和ICG结构相比-并且它们作为荧光团的潜在可调性;但很少有人将其作为PS进行探索。在本工作中，我们合理设计了一个化学平台，以解决现有近红外PS的主要局限性，并合成了新的可活化的半花青动力剂，其具有以下属性:1)在700-800 nm范围内通过照明产生单线态氧气，2)引入水溶性部分(如肽，聚乙二醇(PEG))的化学基团，3)通过加入酶激活的笼化基团来实现PS活性的模块化，以及4)良好的安全性，用于体内抗癌PDT。我们可以通过取代桥接杂原子来微调荧光团和PS的光物理性质;因此，我们将这一策略应用于半花青碱支架，并生产了新的可激活的PS，可以在超过700 nm的波长下激发。此外，考虑到重原子可以稳定三重态并增强PS活性，我们设计了一种将Se作为桥接原子的合成方法，并制备了sebridging半花青碱作为潜在的NIR-I活化PS。在不同的策略合成o -桥联半菁中，在基本条件下用间苯二酚亲核取代Cy7氯是简单的，并且具有良好的收率。我们研究了它们的光学和光动力学性质，并将它们与o桥和s桥的对偶物进行了比较。硒桥接化合物5b表现出适合近红外PDT激发的特性，其最大吸光度波长约为750 nm(即比化合物13和14分别长约60 nm和25 nm)，证实了在其他荧光染料中观察到的O原子被Se原子取代后的色移。我们还检测了它们的近红外光动力学活性，发现化合物5b的单线态氧(1O2)生成率明显高于化合物13和14。这些结果是由于重原子效应，证实了含酚硒桥联半菁作为可活化PDT剂的适用性。   

由于硒桥接的半青碱比其他桥接原子表现出更好的光动力学作用，我们评估了吲哚基团的取代是否会影响它们的光学行为。化合物5a-5e的激发波长都在750 nm左右，消光系数相似。我们还测量了它们的¹O₂生成速率，发现它们都表现为NIR-I PS，它们的光敏功率没有显著差异，这表明吲哚基团的位置5的取代对硒桥半菁的光敏行为并不重要。鉴于化合物5a的化学简单性和低分子量(即<500 Da)，我们将重点放在该结构上，以探索其作为可活化PS的潜力，并制备了相应的笼化化合物6，其中苯酚基团被甲氧基保护。化合物6显示出一种次色移，其最大吸光度波长明显缩短(即约620 nm)，并且NIR-I区域的吸光度降低(即750 nm处的吸光度值降低了5倍，图2d)。此外，笼化化合物6在NIR-I激发(720 nm)下产生的¹O₂显著减少，证实了苯酚基团作为可活化PS制备的可调位点的效用。最后，我们比较了化合物5a和6在多种人类癌细胞系中的光毒性谱，包括HT29(结肠癌)、HeLa(宫颈癌)、LN18(脑)和MDA-MB-231(乳腺癌)。在这些实验中，我们观察到化合物5a表现出边际暗毒性(<10%)，并且在NIR-I激发后能够杀死所有癌细胞，而化合物6在相同的实验条件下没有光毒性。综上所述，这些结果表明，通过正交衰减，苯酚硒桥联半菁胺是可调的NIR-I PS用于靶向PDT。    

酶响应硒代半花菁染料的体外光动力学治疗

我们的hcatb活化PDT试剂的分子设计包括四个不同的化学部分，即1)作为hcatb可切割肽底物的Gly-Phe-LeuGly或vali - cit， 2)自溶的4-氨基苄醇连接物，3)通过苯酚基团连接到连接物的硒桥接半氨基苯胺PS，以及4)提高水溶性的生物相容性部分(即磺酸基，PEG或含羧酸的单元)。通过这种化学设计，我们设想笼化的PS和hCatB之间的反应将切割肽底物，然后进行分子内环化，同时释放未笼化的PS。化合物15-18采用固相肽合成的标准程序合成，经高效液相色谱纯化后纯度>95%。

首先，我们使用HPLC-MS分析评估了所有酶激活化合物15-18对hCatB的反应性。值得注意的是，我们观察到hCatB在水介质中与化合物17和18的反应速度比与化合物15和16的反应速度快得多，这可能是由于后者的水溶性有限。鉴于这些结果，我们检测了化合物17和18在癌细胞中的光毒性。在这些实验中，我们使用了人类U87胶质母细胞瘤细胞，这是一种具有组织蛋白酶活性的侵袭性脑癌细胞。我们用化合物18孵育U87细胞，发现只有当细胞与PS孵育并随后用NIR-I光照射时，才会出现高水平的细胞毒性。相反，化合物17的光毒性可以忽略不计，这可能是由于其带负电荷的结构和阻碍细胞通透性。我们证实了化合物18对hCatB对肿瘤中发现的其他人类蛋白酶(如caspase、颗粒酶、基质金属蛋白酶、中性粒细胞弹性酶)的选择性，并证明了其杀死其他癌细胞的能力)。我们还分析了它在hCatB抑制剂E-64存在下的光动力学活性。，化合物18和E-64之间的竞争实验阻断了近红外硒桥半菁氨酸的释放，表明对CatB活性有很强的依赖性。此外，我们观察到，当化合物18在E-64存在下孵育时，U87细胞的单线态氧生成水平和光毒性显著降低。总之，这些结果表明化合物18作为组织蛋白酶激活的半花青素PS具有抗癌PDT的潜力，并且与无毒NIR-I照明兼容。    

酶响应硒代半花菁染料的体内光动力学治疗    

鉴于化合物18的靶向能力，我们评估了它是否可以在体内安全地消融来自U87胶质母细胞瘤细胞的微肿瘤。在这些实验中，我们使用斑马鱼模型，将U87细胞注射到受精后48小时(hpf)的斑马鱼胚胎的卵黄囊中形成微肿瘤(直径约12,000µm)。为了获得体内癌细胞死亡的无创读数，我们采用了转基因的u87nlcrimson细胞系，其中活细胞Crimson报告细胞的荧光发射与U87细胞的活力成正比。将荧光微肿瘤移植到斑马鱼幼虫体内，我们在NIR-I光(720 nm)或化合物18单独照射后，以及用化合物18处理后再进行NIR-I照射后，对肿瘤肿块进行监测。值得注意的是，我们观察到PDT治疗后肿瘤体积显著减少，一些斑马鱼缺乏荧光U87细胞(图S19)。相比之下，仅用光或化合物18治疗的组观察到微小差异，突出了我们靶向抗癌PDT策略的有效性。此外，我们在相同的实验条件下，使用不可切割的硒桥联半花青碱类似物(化合物19)以及ICG进行了额外的体内实验。值得注意的是，在这些实验中，我们没有观察到肿瘤质量的减少(对于化合物19)或肿瘤质量的轻微减少(对于ICG)，这突出了化合物18在NIR介导的抗癌PDT中的体内活性增强。

最后，我们检查了硒桥半花青碱PS和NIR-I照明相结合的PDT治疗的体内安全性和潜在副作用。具体来说，我们没有观察到用化合物18处理和NIR-I光照射的斑马鱼的形态或心跳有任何异常。此外，我们比较了未经处理和双重处理的斑马鱼组的行为，发现它们的游泳行为和对环境刺激的反应没有差异。总之，这些结果突出了化合物18用于靶向近红外PDT的良好安全性，并断言靶向catb活化硒桥接半菁用于临床前癌症模型中微肿瘤的体内消融。    

总结

我们设计了一个基于硒桥联半菁胺的可扩展合成生物相容性和可活化的NIR-I PS的化学平台。我们证明了对硒桥半菁中苯酚部分的化学修饰导致其光动力学活性显著降低，并可用于制备靶向PDT剂，用于癌细胞的酶促降解。我们通过合成第一批具有选择性反应性的NIR-I有机PS，证明了该平台的多功能性，这些PS可以对抗人类组织蛋白酶B作为癌细胞中的相关生物标志物。在一小部分生物相容性PS中，化合物18在人U87胶质母细胞瘤细胞中表现出最高的组织蛋白酶和光依赖性光毒性。此外，我们使用化合物18在无毒NIR-I光照射后安全地消融斑马鱼临床前癌症模型中的U87微肿瘤。总之，该平台为靶向PDT的新型酶激活近红外有机PS的分子设计提供了一条有希望的途径。

参考文献

Enzyme-Activatable Near-Infrared Hemicyanines as Modular Scaffolds for in vivo Photodynamic Therapy Zhiming Cheng,  Sam Benson, Lorena Mendive-Tapia, Eleni Nestoros, Charles Lochenie,  Deborah Seah,  Kai Yee Chang, Yi Feng,  Marc Vendrell,*Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202404587，https://doi.org/10.1002/anie.202404587    

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